各種凝膠在結構上是很相似的，都是三維空間網狀交織的高分子聚合物。分離程度主要取決于凝膠顆粒內部微孔的孔徑和混合物的分子量這兩個因素。微孔孔徑的大小與凝膠物質中凝膠濃度的平方根呈反比，與凝膠聚合物分子的平均直徑呈正比（其聚合物分子近似地當做球形）。和凝膠孔徑直接關聯的是凝膠的交聯度，交聯度越高，孔徑越小；反之，孔徑就大。移動緩慢的小分子物質，在低交聯度的凝膠上不容易分離，大分子同小分子物質的分離也宜用高交聯度的凝膠。葡聚糖凝膠的交聯度隨每克干燥凝膠的吸水量的增加而遞減。

根據具體實驗情況決定洗脫液的流速，一般采用30~200mL/h。流速過快會使色譜帶變形，影響分離效果，流速的調節可采用靜液壓法裝置。

非水溶性物質的洗脫，采用有機溶劑，水溶性物質的洗脫，一般采用水或具有不同離子強度和pH的緩沖液。離子強度的變化，對于物質的分離有不同的影響。在洗脫堿性蛋白時，洗脫劑中必須含有一定濃度的無機鹽，而且隨著鹽濃度的增加，移動加快。pI低于7的蛋白質的洗脫，很少受離子強度變化的影響。在酸性pH時，堿性物質易于洗脫。多糖類物質洗脫以水最佳。

凝膠色譜很少用在分離純化的開始階段。為了達到良好的分離效果，柱子的上樣量必須保持較小的體積。對于蛋白質來說，上樣量通常為柱體積的2%~5%。樣品中含有雜質太多時就有可能堵塞柱子。凝膠色譜通常用在分離純化的最后階段，此時的目的產物已經比較純，濃度較高。樣品加到色譜柱后，選用合適的洗脫液進行洗脫，通常目的產物被稀釋很多倍。